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常州电泳加工迁移率迁移测定法广泛用于凝胶电泳

2020-12-18 17:01:20

常州电泳加工迁移率迁移测定法广泛用于凝胶电泳,以研究装载到同一孔中的不同分子之间的结合相互作用。但是,如果试剂的单独条带可能发生碰撞反应,则移位分析只能访问一部分反应可能性,否则可能会看到这些反应。在这里,我们通过在同一泳道上制造两个或更多孔,为这些孔加载不同的试剂种类,并施加电场来适应凝胶电泳,从而在这些种类的传播的脉冲状谱带之间产生碰撞反应,我们对其进行光学成像。对于某些成对的阴离子和阳离子染料,传播带彼此不受干扰地穿过;然而,对于其他对,我们观察到络合和沉淀反应,表明强烈的吸引力相互作用。我们将这种带碰撞凝胶电泳方法推广到其他反应类型,包括酸碱,配体交换和氧化还原,以及钝化大孔凝胶中的胶体物种。

凝胶电泳(GE)是一种强大的技术,可基于其电泳迁移率μe表征和分离溶剂化的离子分子或胶体物种。将这些物质装入浸在电解质缓冲液1,2,3,4,5,6中的纳米多孔弹性凝胶中的孔中,然后在两个惰性电极之间施加电场。对于分析聚阴离子DNA和RNA,GE是一项极为重要的技术,可提供高分辨率的多核酸长度测量结果[7,8,9]。此外,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)10,11,12,GE可用于多种蛋白质。脉冲的13、14、15、2D16、17、18和3D19、20、21形式进一步拓宽了GE。

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无锡电泳加工迁移率变动分析(EMSA)22、23、24通过探测装载在凝胶中同一单个孔中的大分子物种(例如蛋白质和多核酸)之间的相互作用,大大扩展了GE。在预定的相互作用持续时间之后,施加电场以引起分离。 EMSA通常用于探测平衡的生物分子结合,因为两个结合的物种通?;岱直鸫?,而不是分别传播,因此在基因组表达领域非常重要25,26。除平衡结合外,EMSA还用于测量解离动力学[27,28,29,30,31,32,33,34,35]。此外,竞争配体之间的相对结合常数,反应顺序,速率常数和Arrhenius参数可以使用EMSAs28进行测量。在某些情况下,EMSA还有助于推导反应机理30和反应性中间体33的存在。 EMSAs27已经发现某些突变型酶和野生型酶之间结合效率的差异。在EMSA31期间,某些短暂的瞬时蛋白质-DNA复合物可以在聚丙烯酰胺凝胶基质中保留数小时。这种持久性很可能是由凝胶基质引起的笼效应引起的,该笼效应大大降低了这种长生物分子的解复合速率29。因此,EMSA不仅用于研究溶液中的动力学(例如在加样孔内),而且还用于研究多孔凝胶基质中的动力学。 EMSA也已在不同的pH和离子强度下进行34。尽管EMSA提供了有关生物分子结合的有用见解,但将反应物物种装载到同一孔中却限制了EMSA固有的协议可用于其他类型的反应。相应地,凝胶死区时间限制了动力学的时间分辨率,因为在激活电场之后,通常有必要等待可能形成的任何复合物离开孔并进入凝胶,然后才能监测这种结合相互作用28。而且,可以使用克服EMSA某些局限性的不同GE方法来探索和可视化反应动力学。

染料分子将为展示出这种不同的GE方法提供许多优势,这主要是因为许多染料带有电荷,通常比凝胶的特征孔径小得多,并且可以很容易地视为光吸收的结果。数十年前使用分光光度法[36,37]观察到,某些成对的不同染料分子会在大量水溶液的混合物中吸引并形成络合物甚至沉淀。两个不同染料分子之间的吸引程度可能涉及静电,疏水和π堆积相互作用; 38空间效应40和分子的内部柔韧性也很重要。此外,酸性(阴离子)染料和碱性(阳离子)染料之间的短程筛选静电引力41可以增强络合物的形成和沉淀,从而导致许多阴离子-阳离子染料混合物的光吸收光谱无可加性。因此,染料分子代表了潜在试剂的重要子集,可轻易证明超越EMSA的任何新的反应性GE方法。


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